次氯酸鈣大腸杆菌（jun1）殺（shā）滅率檢測技術規範與方法優化研究

次氯（lǜ）酸鈣（gài）大腸杆菌殺（shā）滅率檢測技術規範與方法優化研究

一、檢測原理（lǐ）與標準依據

（一）殺菌機製

次氯酸（suān）鈣溶於水釋放次氯酸（HClO），通過以下途徑殺（shā）滅大腸杆菌（Escherichia coli 8099）：

1.細胞膜破壞（huài）：HClO穿透細胞壁，氧化磷脂雙分子（zǐ）層；

2.蛋白質變性（xìng）：與酶活性中心（xīn）巰基（-SH）反應，抑製代謝酶活性；

3.DNA損傷：破壞核酸結構，阻止細胞複製1。

（二）標準方法

國標（biāo）：GB/T 27952-2020《消（xiāo）毒劑衛生要求》懸液定量殺滅試驗；

國際標準：EN 1276《化學消毒劑和防腐劑 食（shí）品、工業、家庭和公共區域用化學消毒劑殺菌活（huó）性評價》2。

二、試驗材（cái）料與試劑配製

（一）菌株與培養基

1.標準菌株：大腸杆菌8099（CMCC(B) 44102），由中國普通微生物菌（jun1）種保（bǎo）藏中心提（tí）供；

2.培養基（jī）：營養瓊脂（NA），pH 7.0±0.2，121℃滅（miè）菌20分鍾1。

（二）關鍵試劑

次氯（lǜ）酸鈣溶液：

母液：稱（chēng）取0.5 g次氯酸鈣（有效氯65%），用無菌水溶解定容至100 mL，有效氯濃度3250 mg/L；

工作液：用PBS稀釋至500 mg/L（按殺滅要求調整）3。

中和劑：

0.1%硫代liu酸鈉（nà）（Na₂S₂O₃）溶（róng）液，中和有效氯至＜0.1 mg/L1。

三、試驗流程與操作規範

（一）菌懸液製（zhì）備（bèi）

活（huó）化（huà）培（péi）養（yǎng）：

將凍幹菌種接種至NA斜麵，37℃培（péi）養（yǎng）18-24小時；

挑取單菌落（luò）轉接至營養肉湯（tāng），37℃振蕩培養6小時（對數生（shēng）長期）。

稀（xī）釋與幹擾物添加：

用0.03 mol/L PBS（含10%小牛血清）稀釋菌液至1×10⁸ CFU/mL；

混勻後備用，2小時（shí）內使用2。

（二）殺滅（miè）試驗步驟

樣品處理：

取5 mL次氯酸鈣（gài）工作液（500 mg/L）至滅菌試管，37℃水浴預熱5分鍾；

加入5 mL菌懸液（1×10⁸ CFU/mL），立（lì）即計時並混勻。

作用與終止：

20℃±1℃避光（guāng）作用10分鍾（按產品說明書（shū）調整作用時間）；

取1.0 mL混合液至9.0 mL中和劑，混勻後靜置10分鍾1。

培養與（yǔ）計數：

取中和後液體1.0 mL，用PBS梯度稀釋（10⁻¹-10⁻³）；

各稀釋度取0.5 mL傾注NA平板，37℃培養48小時，計數菌落數（CFU）2。

（三）對照組設置

對照組類型操作步驟作（zuò）用

陽性對照組菌懸液+PBS（不加消毒劑）驗證菌活性

陰性對照組中和劑+培養基驗證無（wú）菌操作

中和劑對照組消毒劑+中和（hé）劑+菌懸液驗證（zhèng）中和劑有效性

四、結果計算與判定標準

（一（yī））殺滅率計算（suàn）

殺滅率（lǜ）（）

符號說明：

試驗組活菌數（CFU/mL）；

陽性對照組（zǔ）活（huó）菌數（CFU/mL）1。

（二）判定標準

產品類型作用時間（min）有效氯濃度（mg/L）殺 滅率要求（%）

飲用水消毒劑                             10                          500≥99.9

物體表麵消毒劑                     5                                 800≥99.99

五、影響因素與優化策略（luè）

（一）關鍵因素控製

因素                            優化條件                                         效果

有（yǒu）效氯濃（nóng）度  500-1000 mg/L（根（gēn）據有機物調整（zhěng））  殺（shā）滅（miè）率提升至99.99%

作（zuò）用pH               6.5-7.5（中性條件（jiàn））                  HClO占比達80%以上

溫度20-25℃         溫度每（měi）升高10℃，                           殺滅時間縮短（duǎn）一半

（二）常見問題（tí）解決方案

問題現象                                 原因分析                                  解決措施（shī）

殺滅率偏低（dī）有 效氯濃（nóng）度（dù）不足或中和劑過量重新標定（dìng）濃度，調整中和劑用量至9 mL

菌落蔓（màn）延                            菌懸（xuán）液濃度過高                         增加稀釋梯度至10⁻⁴

中和劑失效                  硫代liu酸鈉氧化                          使（shǐ）用新鮮配製的中和劑

六、質量控製與應用場景（jǐng）

（一）質控指標

1.菌懸（xuán）液濃度：1×10⁸±0.5×10⁸ CFU/mL；

2.中和劑有效性：中（zhōng）和後殘留菌數≤10 CFU/mL2。

（二）典型應用（yòng）

1.飲用水消毒：驗證次氯酸鈣（gài）投加後大腸杆菌達標（≤0 CFU/100 mL）；

2.醫療環（huán）境表麵：物體表麵擦拭後殺滅率≥99.99%1。

關鍵詞：次氯酸鈣；大腸杆菌（jun1）；殺（shā）滅率；懸液定量（liàng）試驗；GB/T 27952

參考文獻

[1] GB/T 27952-2020 消毒劑（jì）衛生要求[S].

[2] EN 1276 化學消毒劑殺（shā）菌活性評價[S].

[3] WHO 飲用水消毒指南[S].